Kleuring vir RAD51 (helder siaankleurige kolletjie) in 'n bevrugte eenselmuisembrio toon herstel van 'n CRISPR-geïnduseerde DNA-breuk. Krediet: Beeld met vergunning van die navorsers.
Nuwe metode, ontwikkel deur McGovern Institute-navorsers, kan lei tot veiliger, meer doeltreffende geenterapieë.
Geenredigering, of doelgerigte verandering van 'n geen se DNS-volgorde, is 'n kragtige hulpmiddel om te bestudeer hoe mutasies siektes veroorsaak, en om veranderinge in 'n individu se DNS vir terapeutiese doeleindes aan te bring. 'n Nuwe metode van geenredigering wat vir beide doeleindes gebruik kan word, is nou ontwikkel deur 'n span gelei deur Guoping Feng, die James W. (1963) en Patricia T. Poitras Professor in Brein- en Kognitiewe Wetenskappe by MIT.
"Hierdie tegniese vooruitgang kan die produksie van siektemodelle by diere versnel en, krities, 'n splinternuwe metodologie oopmaak om siekteveroorsakende mutasies reg te stel," sê Feng, wat ook 'n lid is van die Breë Instituut van Harvard en MIT en die mede-direkteur van die McGovern-instituut vir breinnavorsing by MIT. Die nuwe bevindinge is op 26 Mei 2021 aanlyn in die joernaal gepubliseer Cell.
Genetiese modelle van siekte
'n Groot doel van die Feng-laboratorium is om presies te definieer wat verkeerd gaan in neuro-ontwikkelings- en neuropsigiatriese versteurings deur diermodelle te ontwerp wat die geenmutasies dra wat hierdie versteurings by mense veroorsaak. Nuwe modelle kan gegenereer word deur embrio's met geen-redigeergereedskap in te spuit, saam met 'n stuk DNA wat die verlangde mutasie dra.
In een so 'n metode word die geenredigeringsinstrument CRISPR geprogrammeer om 'n geteikende geen te sny, en sodoende natuurlike DNS-meganismes te aktiveer wat die gebroke geen met die ingespuite sjabloon DNS "herstel". Die gemanipuleerde selle word dan gebruik om nageslag te genereer wat in staat is om die genetiese verandering na verdere generasies oor te dra, wat 'n stabiele genetiese lyn skep waarin die siekte en terapieë getoets word.
Alhoewel CRISPR die proses van die generering van sulke siektemodelle versnel het, kan die proses steeds maande of jare duur. Redes vir die ondoeltreffendheid is dat baie behandelde selle glad nie die verlangde DNA-volgordeverandering ondergaan nie, en die verandering vind slegs op een van die twee geenkopieë plaas (vir die meeste gene bevat elke sel twee weergawes, een van die vader en een van die moeder).
In 'n poging om die doeltreffendheid van die geenredigeringsproses te verhoog, het die Feng-laboratoriumspan aanvanklik veronderstel dat die byvoeging van 'n DNA-herstelproteïen genaamd RAD51 by 'n standaardmengsel van CRISPR-geenredigeringsinstrumente die kanse sou verhoog dat 'n sel (in hierdie geval 'n bevrugte muis) eier, of eensel-embrio) die gewenste genetiese verandering sou ondergaan.
As 'n toetsgeval het hulle die tempo gemeet waarteen hulle 'n mutasie in die geen kon invoeg (“knock-in”) Chd2 wat met outisme geassosieer word. Die algehele proporsie embrio's wat korrek geredigeer is, het onveranderd gebly, maar tot hul verbasing het 'n aansienlik hoër persentasie die verlangde geenwysiging op beide chromosome gedra. Toetse met 'n ander geen het dieselfde onverwagte uitkoms opgelewer.
"Om beide chromosome gelyktydig te wysig is normaalweg baie ongewoon," verduidelik postdoktor Jonathan Wilde. "Die hoë koers van redigering wat met RAD51 gesien is, was regtig opvallend, en wat begin het as 'n eenvoudige poging om mutant te maak Chd2 muise het vinnig verander in 'n veel groter projek gefokus op RAD51 en sy toepassings in genoomredigering,” sê Wilde, wat mede-outeur van die Cell referaat met navorsingswetenskaplike Tomomi Aida.
'n Molekulêre kopieermasjien
Die Feng-laboratoriumspan het daarna begin om die meganisme te verstaan waardeur RAD51 geenredigering verbeter. Hulle het veronderstel dat RAD51 'n proses genaamd interhomolog herstel (IHR) betrek, waardeur 'n DNA-breuk op een chromosoom herstel word deur die tweede kopie van die chromosoom (van die ander ouer) as die sjabloon te gebruik.
Om dit te toets, het hulle muisembrio's met RAD51 en CRISPR ingespuit, maar die sjabloon-DNS uitgelaat. Hulle het CRISPR geprogrammeer om slegs die geenvolgorde op een van die chromosome te sny, en toe getoets of dit herstel is om by die volgorde op die ongesnyde chromosoom te pas. Vir hierdie eksperiment moes hulle muise gebruik waarin die volgordes op die moederlike en vaderlike chromosome verskillend was.
Hulle het bevind dat kontrole-embrio's wat met CRISPR alleen ingespuit is, selde IHR-herstel getoon het. Byvoeging van RAD51 het egter die aantal embrio's waarin die CRISPR-gerigte geen geredigeer is om by die ongesnyde chromosoom te pas, aansienlik verhoog.
"Vorige studies van IHR het bevind dat dit in die meeste selle ongelooflik ondoeltreffend is," sê Wilde. "Ons bevinding dat dit baie makliker in embrioniese selle voorkom en deur RAD51 versterk kan word, dui daarop dat 'n dieper begrip van wat die embrio toelaatbaar maak vir hierdie tipe DNA-herstel, ons kan help om veiliger en doeltreffender geenterapieë te ontwerp."
'n Nuwe manier om siekteveroorsakende mutasies reg te stel
Standaard geenterapie-strategieë wat staatmaak op die inspuiting van 'n korrektiewe stuk DNA om te dien as 'n sjabloon vir die herstel van die mutasie, betrek 'n proses wat homologie-gerigte herstel (HDR) genoem word.
"HDR-gebaseerde strategieë ly steeds aan lae doeltreffendheid en dra die risiko van ongewenste integrasie van skenker-DNS deur die genoom," verduidelik Feng. "IHR het die potensiaal om hierdie probleme te oorkom omdat dit staatmaak op natuurlike sellulêre weë en die pasiënt se eie normale chromosoom vir regstelling van die nadelige mutasie."
Feng se span het voortgegaan om bykomende DNA-herstel-geassosieerde proteïene te identifiseer wat IHR kan stimuleer, insluitend verskeie wat nie net hoë vlakke van IHR bevorder nie, maar ook foute in die DNA-herstelproses onderdruk. Bykomende eksperimente wat die span toegelaat het om die genomiese kenmerke van IHR-gebeure te ondersoek, het dieper insig gegee in die meganisme van IHR en maniere voorgestel waarop die tegniek gebruik kan word om geenterapieë veiliger te maak.
"Al is daar nog baie om te leer oor hierdie nuwe toepassing van IHR, is ons bevindinge die grondslag vir 'n nuwe geenterapie-benadering wat kan help om van die groot probleme met huidige benaderings op te los," sê Aida.
Verwysing: "Doeltreffende embrioniese homosigotiese geenomskakeling via RAD51-verbeterde interhomolog herstel" deur Jonathan J. Wilde, Tomomi Aida, Ricardo CH del Rosario, Tobias Kaiser, Peimin Qi, Martin Wienisch, Qiangge Zhang, Steven Colvin en Guoping Feng, 26 Mei 2021 , Cell.
DOI: 10.1016/j.cell.2021.04.035
Hierdie studie is ondersteun deur die Hock E. Tan en K. Lisa Yang Sentrum vir Outisme Navorsing by MIT, die Poitras Sentrum vir Psigiatriese Afwykings Navorsing by MIT, 'n NIH/NIMH Conte Center Grant, en die NIH Kantoor van die Direkteur.
