Varios medicamentos aprobados por la FDA, incluso para la diabetes tipo 2, la hepatitis C y el VIH, reducen significativamente la capacidad de la variante Delta de SARS-CoV-2 para replicarse en células humanas, según una nueva investigación dirigida por científicos de Penn State. Específicamente, el equipo descubrió que estos medicamentos inhiben ciertas enzimas virales, llamadas proteasas, que son esenciales para la replicación del SARS-CoV-2 en las células humanas infectadas.
“Las vacunas contra el SARS-CoV-2 se dirigen a la proteína espiga, pero esta proteína está bajo una fuerte presión de selección y, como hemos visto con Omicron, puede sufrir mutaciones significativas”, dijo Joyce Jose, profesora asistente de bioquímica y biología molecular en Penn State. . “Sigue existiendo una necesidad urgente de agentes terapéuticos para el SARS-CoV-2 que se dirijan a partes del virus que no sean la proteína espiga que no tienen tanta probabilidad de evolucionar”.
Investigaciones anteriores han demostrado que dos enzimas del SARS-CoV-2, proteasas que incluyen Mpro y PLpro, son objetivos prometedores para el desarrollo de fármacos antivirales. Pfizer's COVID-19 La terapia Paxlovid, por ejemplo, se dirige a Mpro. Según José, estas enzimas son relativamente estables; por lo tanto, es poco probable que desarrollen rápidamente mutaciones resistentes a los medicamentos.
Katsuhiko Murakami, profesor de bioquímica y biología molecular en Penn State, señaló que estas proteasas virales, debido a su capacidad para escindir o cortar proteínas, son esenciales para la replicación del SARS-CoV-2 en las células infectadas.
“El SARS-CoV-2 produce proteínas largas, llamadas poliproteínas, a partir de su moléculas de ARN genoma que debe ser dividido en proteínas individuales por estas proteasas de manera ordenada, lo que lleva a la formación de enzimas y proteínas virales funcionales para iniciar la replicación del virus una vez que ingresa a una célula”, explicó Murakami. “Si inhibe una de estas proteasas, podría detenerse una mayor propagación del SARS-CoV-2 en la persona infectada”.
Los hallazgos fueron publicados hoy (25 de febrero de 2022) en la revista Biología de las Comunicaciones.
El equipo diseñó un ensayo para identificar rápidamente los inhibidores de las proteasas Mpro y PLpro en células humanas vivas.
“Aunque hay otros ensayos disponibles, diseñamos nuestro nuevo ensayo para que pudiera realizarse en células vivas, lo que nos permitió medir simultáneamente la toxicidad de los inhibidores para las células humanas”, dijo José.
Los investigadores utilizaron su ensayo para probar una biblioteca de 64 compuestos, incluidos los inhibidores de las proteasas del VIH y la hepatitis C; cisteína proteasas, que se encuentran en ciertos parásitos protozoarios; y dipeptidil peptidasa, una enzima humana involucrada en la diabetes tipo 2, por su capacidad para inhibir Mpro o PLpro. De los 64 compuestos, el equipo identificó once que afectaron la actividad de Mpro y cinco que afectaron la actividad de PLpro en base a una reducción del 50 % en la actividad de la proteasa con un 90 % de viabilidad celular.
Anoop Narayanan, profesor de investigación asociado de bioquímica y biología molecular, supervisó la actividad de los compuestos mediante microscopía confocal en vivo.
“Diseñamos el experimento de modo que si el compuesto afectaba a las proteasas, verías fluorescencia en ciertas áreas de la célula”, dijo Narayanan.
A continuación, el equipo evaluó la actividad antiviral de los 16 inhibidores PLpro y Mpro contra los virus SARS-CoV-2 en células humanas vivas en una instalación BSL-3, el Laboratorio de Investigación Biológica Avanzada Eva J. Pell ABSL-3 en Penn State, y descubrió que ocho de ellos tenían actividades antivirales dependientes de la dosis contra el SARS-CoV-2. Específicamente, encontraron que Sitagliptin y Daclatasvir inhiben PLpro, y MG-101, Lycorine HCl y Nelfinavir mesilato inhiben Mpro. De estos, el equipo encontró que MG-101 también obstaculizó el virus.'Capacidad de s para infectar células al inhibir el procesamiento de proteasa de la proteína de punta.
“Descubrimos que cuando las células se pretrataron con los inhibidores seleccionados, solo MG-101 afectó al virus's entrada en las celdas”, dijo Narayanan.
Además, los investigadores descubrieron que tratar las células con una combinación de inhibidores de Mpro y PLpro tenía un efecto antiviral aditivo, lo que proporcionaba una inhibición aún mayor de la replicación del SARS-CoV-2.
“En cultivo celular, demostramos que si combinas los inhibidores de Mpro y PLpro, tienes un efecto más fuerte sobre el virus sin aumentar la toxicidad”, dijo José. "Esta combinación de inhibición es muy potente".
Para investigar el mecanismo por el cual MG-101 inhibe la actividad de la proteasa Mpro, los científicos, incluido Manju Narwal, académico postdoctoral en bioquímica y biología molecular, utilizaron cristalografía de rayos X para obtener una estructura de alta resolución de MG-101 en complejo con Mpro.
“Pudimos ver cómo MG-101 interactuaba con el sitio activo de Mpro”, dijo Narwal. “Este inhibidor imita a la poliproteína y se une de manera similar a la proteasa, lo que impide que la proteasa se una y corte la poliproteína, que es un paso esencial en el virus.'s replicación.”
Murakami agregó: "Al comprender cómo el compuesto MG-101 se une al sitio activo, podemos diseñar nuevos compuestos que pueden ser aún más efectivos".
De hecho, el equipo está en proceso de diseñar nuevos compuestos basados en las estructuras que determinaron mediante cristalografía de rayos X. También planean probar los medicamentos combinados que ya demostraron ser efectivos in vitro en ratones.
Aunque los científicos estudiaron la variante Delta del SARS-CoV-2, dijeron que los medicamentos probablemente serán efectivos contra Omicron y futuras variantes porque se dirigen a partes del virus que es poco probable que muten significativamente.
“El desarrollo de medicamentos antivirales de amplio espectro contra una amplia gama de coronavirus es la última estrategia de tratamiento para las infecciones por coronavirus emergentes y circulantes”, dijo José. “Nuestra investigación muestra que la reutilización de ciertos medicamentos aprobados por la FDA que demuestran eficacia para inhibir las actividades de Mpro y PLpro puede ser una estrategia útil en la lucha contra el SARS-CoV-2”.
Referencia: "Identificación de los inhibidores del SARS-CoV-2 dirigidos a Mpro y PLpro usando un ensayo de proteasa en la célula" por Anoop Narayanan, Manju Narwal, Sydney A. Majowicz, Carmine Varricchio, Shay A. Toner, Carlo Ballatore, Andrea Brancale, Katsuhiko S. Murakami y Joyce José, 25 de febrero de 2022, Biología de las Comunicaciones.
DOI: 10.1038/s42003-022-03090-9
Otros autores del artículo incluyen a Sydney A. Majowicz, estudiante de posgrado, y Shay A. Toner, estudiante de pregrado, Penn State; Carmine Varricchio, investigadora asociada posdoctoral, y Andrea Brancale, profesora de química médica de la Universidad de Cardiff; y Carlo Ballatore, profesor de química médica de la Universidad de California, San Diego.
Los Institutos Nacionales de Salud, la Oficina de Ciencias del Gobierno de Gales y los Institutos Huck de Ciencias de la Vida en Penn State (COVID-19 Seed Grant for Jose Laboratory) apoyaron esta investigación.
