Несколько одобренных FDA препаратов, в том числе для лечения диабета 2 типа, гепатита С и ВИЧ, значительно снижают способность дельта-варианта ТОРС-коронавирус-2 воспроизводиться в клетках человека, согласно новому исследованию, проведенному учеными из Университета штата Пенсильвания. В частности, команда обнаружила, что эти препараты ингибируют определенные вирусные ферменты, называемые протеазами, которые необходимы для репликации SARS-CoV-2 в инфицированных клетках человека.
«Вакцины против SARS-CoV-2 нацелены на шиповидный белок, но этот белок находится под сильным давлением отбора и, как мы видели с Omicron, может подвергаться значительным мутациям», — сказала Джойс Хосе, доцент кафедры биохимии и молекулярной биологии Пенсильванского университета. . «Сохраняется острая потребность в терапевтических агентах для SARS-CoV-2, нацеленных на части вируса, отличные от шиповидного белка, которые вряд ли эволюционируют».
Предыдущие исследования показали, что два фермента SARS-CoV-2 — протеазы, включая Mpro и PLpro — являются многообещающими мишенями для разработки противовирусных препаратов. Пфайзер"s Covid-19. Терапия Паксловид, например, нацелена на Mpro. По словам Хосе, эти ферменты относительно стабильны; поэтому маловероятно, что у них быстро разовьются лекарственно-устойчивые мутации.
Кацухико Мураками, профессор биохимии и молекулярной биологии Пенсильванского университета, отметил, что эти вирусные протеазы из-за их способности расщеплять или разрезать белки необходимы для репликации SARS-CoV-2 в инфицированных клетках.
«SARS-CoV-2 производит длинные белки, называемые полипротеинами, из своего РНК геном, который должен быть расщеплен этими протеазами на отдельные белки в упорядоченном порядке, что приводит к образованию функциональных вирусных ферментов и белков, чтобы начать репликацию вируса после того, как он попадет в клетку», — пояснил Мураками. «Если вы ингибируете одну из этих протеаз, дальнейшее распространение SARS-CoV-2 у инфицированного человека может быть остановлено».
Результаты были опубликованы сегодня (25 февраля 2022 г.) в журнале Коммуникационная биология.
Команда разработала тест для быстрой идентификации ингибиторов протеаз Mpro и PLpro в живых клетках человека.
«Хотя доступны и другие тесты, мы разработали наш новый анализ таким образом, чтобы его можно было проводить в живых клетках, что позволило нам одновременно измерить токсичность ингибиторов для клеток человека», — сказал Хосе.
Исследователи использовали свой анализ для тестирования библиотеки из 64 соединений, включая ингибиторы протеаз ВИЧ и гепатита С; цистеиновые протеазы, встречающиеся у некоторых простейших паразитов; и дипептидилпептидаза, человеческий фермент, участвующий в развитии диабета 2 типа, — за их способность ингибировать Mpro или PLpro. Из 64 соединений команда определила одиннадцать, которые влияли на активность Mpro, и пять, которые влияли на активность PLpro, исходя из порогового значения 50% снижения активности протеазы при 90% жизнеспособности клеток.
Ануп Нараянан, адъюнкт-профессор биохимии и молекулярной биологии, контролировал активность соединений с помощью живой конфокальной микроскопии.
«Мы разработали эксперимент таким образом, чтобы, если соединение воздействовало на протеазы, вы могли видеть флуоресценцию в определенных областях клетки», — сказал Нараянан.
Затем команда оценила противовирусную активность 16 ингибиторов PLpro и Mpro против вирусов SARS-CoV-2 в живых клетках человека на объекте BSL-3, Лаборатории передовых биологических исследований Eva J. Pell ABSL-3 в Пенсильвании. и обнаружили, что восемь из них обладают дозозависимой противовирусной активностью против SARS-CoV-2. В частности, они обнаружили, что ситаглиптин и даклатасвир ингибируют PLpro, а MG-101, ликорина HCl и нелфинавира мезилат ингибируют Mpro. Из них команда обнаружила, что MG-101 также препятствует распространению вируса."способность инфицировать клетки путем ингибирования протеазного процессинга шиповидного белка.
«Мы обнаружили, что когда клетки были предварительно обработаны выбранными ингибиторами, только MG-101 воздействовал на вирус."вход в клетки», — сказал Нараянан.
Кроме того, исследователи обнаружили, что обработка клеток комбинацией ингибиторов Mpro и PLpro оказывает дополнительный противовирусный эффект, обеспечивая еще большее подавление репликации SARS-CoV-2.
«В культуре клеток мы показали, что если вы комбинируете ингибиторы Mpro и PLpro, вы оказываете более сильное воздействие на вирус без повышения токсичности», — сказал Хосе. «Это комбинированное торможение очень сильное».
Чтобы исследовать механизм, с помощью которого MG-101 ингибирует активность протеазы Mpro, ученые, в том числе Манджу Нарвал, доктор наук в области биохимии и молекулярной биологии, использовали рентгеновскую кристаллографию для получения структуры MG-101 с высоким разрешением в комплексе с Мпро.
«Мы смогли увидеть, как MG-101 взаимодействует с активным центром Mpro», — сказал Нарвал. «Этот ингибитор имитирует полипротеин и связывается аналогичным образом с протеазой, тем самым блокируя связывание протеазы и разрезание полипротеина, что является важным этапом в вирусе."репликация».
Мураками добавил: «Поняв, как соединение MG-101 связывается с активным центром, мы можем разработать новые соединения, которые могут быть еще более эффективными».
Действительно, команда находится в процессе разработки новых соединений на основе структур, определенных ими с помощью рентгеновской кристаллографии. Они также планируют протестировать комбинированные препараты, эффективность которых уже продемонстрирована на мышах in vitro.
Хотя ученые изучали дельта-вариант SARS-CoV-2, они заявили, что препараты, вероятно, будут эффективны против Omicron и будущих вариантов, поскольку они нацелены на части вируса, которые вряд ли будут значительно мутировать.
«Разработка противовирусных препаратов широкого спектра действия против широкого спектра коронавирусов — это окончательная стратегия лечения циркулирующих и возникающих коронавирусных инфекций», — сказал Хосе. «Наше исследование показывает, что перепрофилирование некоторых одобренных FDA препаратов, которые демонстрируют эффективность в подавлении активности Mpro и PLpro, может быть полезной стратегией в борьбе с SARS-CoV-2».
Ссылка: «Идентификация ингибиторов SARS-CoV-2, нацеленных на Mpro и PLpro, с использованием анализа внутриклеточных протеаз», Ануп Нараянан, Манджу Нарвал, Сидней А. Майович, Кармине Варриккио, Шей А. Тонер, Карло Баллаторе, Андреа Бранкале, Кацухико С. Мураками и Джойс Хосе, 25 февраля 2022 г., Коммуникационная биология.
DOI: 10.1038/s42003-022-03090-9
Среди других авторов статьи Сидней А. Майович, аспирант, и Шэй А. Тонер, студентка бакалавриата, Пенсильванский университет; Кармин Варриккио, научный сотрудник с докторской степенью, и Андреа Бранкале, профессор медицинской химии Кардиффского университета; и Карло Баллаторе, профессор медицинской химии Калифорнийского университета в Сан-Диего.
Национальные институты здравоохранения, Управление науки правительства Уэльса и Институт наук о жизни Хака в Пенсильвании (посевной грант COVID-19 для лаборатории Хосе) поддержали это исследование.
