Кілька схвалених FDA препаратів — у тому числі для лікування діабету 2 типу, гепатиту С та ВІЛ — значно знижують здатність варіанту Delta ТОРС-коронавірус-2 розмножуватися в клітинах людини, згідно з новими дослідженнями, проведеними вченими з Penn State. Зокрема, команда виявила, що ці ліки пригнічують певні вірусні ферменти, звані протеазами, які необхідні для реплікації SARS-CoV-2 в інфікованих клітинах людини.
«Вакцини SARS-CoV-2 націлені на білок-шип, але цей білок перебуває під сильним тиском селекції, і, як ми бачили у Omicron, може зазнавати значних мутацій», – сказала Джойс Хосе, доцент біохімії та молекулярної біології, штат Пенсильванія. . «Залишається нагальна потреба в терапевтичних засобах SARS-CoV-2, які націлені на частини вірусу, окрім білка шипа, які не мають такої ймовірності еволюціонувати».
Попередні дослідження продемонстрували, що два ферменти SARS-CoV-2 — протеази, включаючи Mpro та PLpro — є багатообіцяючими мішенями для розробки противірусних препаратів. Pfizer"s COVID-19 терапія Paxlovid, наприклад, спрямована на Mpro. За словами Хосе, ці ферменти відносно стабільні; тому вони навряд чи швидко розвиватимуть стійкі до ліків мутації.
Кацухіко Муракамі, професор біохімії та молекулярної біології, Penn State, зазначив, що ці вірусні протеази через їхню здатність розщеплювати або розрізати білки необхідні для реплікації SARS-CoV-2 в інфікованих клітинах.
«SARS-CoV-2 виробляє довгі білки, які називаються поліпротеїнами РНК геном, який повинен бути розщеплений на окремі білки цими протеазами в упорядкованому порядку, що призводить до утворення функціональних вірусних ферментів і білків, щоб почати реплікацію вірусу, як тільки він потрапляє в клітину», – пояснив Муракамі. «Якщо ви інгібуєте одну з цих протеаз, подальше поширення SARS-CoV-2 серед інфікованої людини можна зупинити».
Висновки були опубліковані сьогодні (25 лютого 2022 р.) у журналі Комунікаційна біологія.
Команда розробила аналіз для швидкого визначення інгібіторів протеаз Mpro і PLpro в живих клітинах людини.
«Хоча доступні й інші аналізи, ми розробили наш новий аналіз, щоб його можна було проводити в живих клітинах, що дозволило нам одночасно виміряти токсичність інгібіторів для клітин людини», — сказав Хосе.
Дослідники використали свій аналіз для перевірки бібліотеки з 64 сполук, включаючи інгібітори протеаз ВІЛ і гепатиту С; цистеїнові протеази, які зустрічаються у деяких найпростіших паразитів; і дипептидилпептидаза, людський фермент, що бере участь у діабеті 2 типу — через їх здатність пригнічувати Mpro або PLpro. Із 64 сполук команда визначила одинадцять, які впливали на активність Mpro, і п’ять, які впливали на активність PLpro на основі 50% зниження активності протеази при 90% життєздатності клітин.
Ануп Нараянан, доцент біохімії та молекулярної біології, контролював активність сполук за допомогою живої конфокальної мікроскопії.
«Ми розробили експеримент так, щоб, якщо з’єднання впливало на протеази, ви побачили б флуоресценцію в певних ділянках клітини», – сказав Нараянан.
Далі команда оцінила противірусну активність 16 інгібіторів PLpro і Mpro проти вірусів SARS-CoV-2 у живих клітинах людини в установі BSL-3, Лабораторії передових біологічних досліджень Єви Дж. Пелл ABSL-3 у штаті Пенсильванія, і виявив, що вісім з них мають дозозалежну противірусну дію проти SARS-CoV-2. Зокрема, вони виявили, що ситагліптин і даклатасвір пригнічують PLpro, а MG-101, лікорин HCl і нелфінавір мезилат інгібують Mpro. З них команда виявила, що MG-101 також перешкоджав поширенню вірусу"s здатність інфікувати клітини, пригнічуючи процесинг протеазою білка спайка.
«Ми виявили, що коли клітини були попередньо оброблені обраними інгібіторами, лише MG-101 впливав на вірус"проникнення в клітини", - сказав Нараянан.
Крім того, дослідники виявили, що обробка клітин комбінацією інгібіторів Mpro та PLpro мала адитивний противірусний ефект, забезпечуючи ще більше пригнічення реплікації SARS-CoV-2.
«У культурі клітин ми показали, що якщо поєднати інгібітори Mpro та PLpro, ви матимете сильніший вплив на вірус без збільшення токсичності», – сказав Хосе. «Це комбіноване гальмування є дуже потужним».
Щоб дослідити механізм, за допомогою якого MG-101 пригнічує активність протеази Mpro, вчені, у тому числі Манджу Нарвал, докторант з біохімії та молекулярної біології, використали рентгенівську кристалографію для отримання структури високої роздільної здатності MG-101 у комплексі з Mpro.
«Ми змогли побачити, як MG-101 взаємодіє з активним сайтом Mpro», – сказав Нарвал. «Цей інгібітор імітує поліпротеїн і зв’язується подібним чином з протеазою, тим самим блокуючи протеазу від зв’язування та розрізання поліпротеїну, що є важливим етапом у вірусі."реплікація».
Муракамі додав: «Зрозумівши, як з’єднання MG-101 зв’язується з активним центром, ми можемо створити нові сполуки, які можуть бути ще більш ефективними».
Дійсно, команда розробляє нові сполуки на основі структур, які вони визначили за допомогою рентгенівської кристалографії. Вони також планують випробувати комбіновані препарати, які вже продемонстрували свою ефективність in vitro на мишах.
Хоча вчені вивчали дельта-варіант SARS-CoV-2, вони сказали, що ліки, ймовірно, будуть ефективними проти Omicron і майбутніх варіантів, оскільки вони націлені на частини вірусу, які навряд чи будуть суттєво мутувати.
«Розробка противірусних препаратів широкого спектру дії проти широкого спектру коронавірусів є остаточною стратегією лікування циркулюючих та нових коронавірусних інфекцій», – сказав Хосе. «Наше дослідження показує, що перепрофілювання деяких схвалених FDA препаратів, які демонструють ефективність у пригніченні активності Mpro та PLpro, може бути корисною стратегією в боротьбі з SARS-CoV-2».
Довідка: «Ідентифікація інгібіторів SARS-CoV-2, спрямованих на Mpro та PLpro за допомогою аналізу внутрішньоклітинної протеази», Ануп Нараянан, Манджу Нарвал, Сідні А. Майович, Кармін Варрічкіо, Шей А. Тонер, Карло Балаторе, Андреа Бранкале, Кацухіко С. Муракамі та Джойс Хосе, 25 лютого 2022 р., Комунікаційна біологія.
DOI: 10.1038/s42003-022-03090-9
Серед інших авторів статті є Сідні А. Майович, аспірант, і Шей А. Тонер, студент бакалавра, штат Пенсильвания; Кармін Варріккіо, докторант наук, і Андреа Бранкале, професор медичної хімії Кардіффського університету; і Карло Баллаторе, професор медичної хімії, Каліфорнійський університет, Сан-Дієго.
Національний інститут охорони здоров’я, Уельський уряд з науки та Інститути наук про життя Гека в штаті Пенсильванія (COVID-19 Seed Grant for Jose Laboratory) підтримали це дослідження.
