Diversi farmaci approvati dalla FDA, inclusi il diabete di tipo 2, l'epatite C e l'HIV, riducono significativamente la capacità della variante Delta di SARS-CoV-2 di replicarsi nelle cellule umane, secondo una nuova ricerca guidata dagli scienziati della Penn State. In particolare, il team ha scoperto che questi farmaci inibiscono alcuni enzimi virali, chiamati proteasi, che sono essenziali per la replicazione di SARS-CoV-2 nelle cellule umane infette.
"I vaccini SARS-CoV-2 prendono di mira la proteina spike, ma questa proteina è sottoposta a una forte pressione di selezione e, come abbiamo visto con Omicron, può subire mutazioni significative", ha affermato Joyce Jose, assistente professore di biochimica e biologia molecolare, Penn State . "Rimane un bisogno urgente di agenti terapeutici SARS-CoV-2 che prendono di mira parti del virus diverse dalla proteina spike che non hanno la stessa probabilità di evolversi".
Ricerche precedenti hanno dimostrato che due enzimi SARS-CoV-2 - le proteasi tra cui Mpro e PLpro - sono obiettivi promettenti per lo sviluppo di farmaci antivirali. Pfizer's COVID-19 terapia Paxlovid, ad esempio, prende di mira Mpro. Secondo Jose, questi enzimi sono relativamente stabili; pertanto, è improbabile che sviluppino rapidamente mutazioni resistenti ai farmaci.
Katsuhiko Murakami, professore di biochimica e biologia molecolare, Penn State, ha osservato che queste proteasi virali, a causa delle loro capacità di scindere o tagliare le proteine, sono essenziali per la replicazione di SARS-CoV-2 nelle cellule infette.
“SARS-CoV-2 produce proteine lunghe, chiamate poliproteine, dalle sue RNA genoma che deve essere scisso in singole proteine da queste proteasi in modo ordinato portando alla formazione di enzimi virali e proteine funzionali per avviare la replicazione del virus una volta che entra in una cellula", ha spiegato Murakami. "Se si inibisce una di queste proteasi, l'ulteriore diffusione di SARS-CoV-2 nella persona infetta potrebbe essere interrotta".
I risultati sono stati pubblicati oggi (25 febbraio 2022) sulla rivista Biologia delle comunicazioni.
Il team ha progettato un test per identificare rapidamente gli inibitori delle proteasi Mpro e PLpro nelle cellule umane vive.
"Sebbene siano disponibili altri test, abbiamo progettato il nostro nuovo test in modo che potesse essere condotto in cellule vive, il che ci ha permesso di misurare simultaneamente la tossicità degli inibitori per le cellule umane", ha affermato Jose.
I ricercatori hanno utilizzato il loro test per testare una libreria di 64 composti, inclusi gli inibitori delle proteasi dell'HIV e dell'epatite C; cisteina proteasi, che si trovano in alcuni protozoi parassiti; e dipeptidil peptidasi, un enzima umano coinvolto nel diabete di tipo 2, per la loro capacità di inibire Mpro o PLpro. Dei 64 composti, il team ha identificato undici che hanno influenzato l'attività di Mpro e cinque che hanno influenzato l'attività di PLpro sulla base di una riduzione del 50% dell'attività della proteasi con una vitalità cellulare del 90%.
Anoop Narayanan, professore associato di biochimica e biologia molecolare, ha monitorato l'attività dei composti utilizzando la microscopia confocale dal vivo.
"Abbiamo progettato l'esperimento in modo tale che se il composto stesse influenzando le proteasi, si vedesse la fluorescenza in alcune aree della cellula", ha detto Narayanan.
Successivamente, il team ha valutato l'attività antivirale dei 16 inibitori PLpro e Mpro contro i virus SARS-CoV-2 in cellule umane vive in una struttura BSL-3, l'Eva J. Pell ABSL-3 Laboratory for Advanced Biological Research presso Penn State, e ha scoperto che otto di loro avevano attività antivirali dose-dipendenti contro SARS-CoV-2. In particolare, hanno scoperto che Sitagliptin e Daclatasvir inibiscono PLpro e MG-101, licorina HCl e Nelfinavir mesilato inibiscono Mpro. Di questi, il team ha scoperto che anche MG-101 ha ostacolato il virus's capacità di infettare le cellule inibendo l'elaborazione della proteasi della proteina spike.
“Abbiamo scoperto che quando le cellule sono state pretrattate con gli inibitori selezionati, solo MG-101 ha colpito il virus's ingresso nelle cellule", ha detto Narayanan.
Inoltre, i ricercatori hanno scoperto che il trattamento delle cellule con una combinazione di inibitori di Mpro e PLpro aveva un effetto antivirale additivo, fornendo un'inibizione ancora maggiore della replicazione di SARS-CoV-2.
"Nella coltura cellulare, abbiamo dimostrato che se si combinano gli inibitori Mpro e PLpro, si ha un effetto più forte sul virus senza aumentare la tossicità", ha affermato Jose. "Questa inibizione combinata è molto potente."
Per studiare il meccanismo mediante il quale MG-101 inibisce l'attività della proteasi Mpro, gli scienziati, tra cui Manju Narwal, studioso post-dottorato in biochimica e biologia molecolare, hanno utilizzato la cristallografia a raggi X per ottenere una struttura ad alta risoluzione di MG-101 in complesso con Mpro.
"Siamo stati in grado di vedere come MG-101 stava interagendo con il sito attivo di Mpro", ha affermato Narwal. “Questo inibitore imita la poliproteina e si lega in modo simile alla proteasi, impedendo così alla proteasi di legarsi e tagliare la poliproteina, che è un passaggio essenziale nel virus'replicazione”.
Murakami ha aggiunto: "Capendo come il composto MG-101 si lega al sito attivo, possiamo progettare nuovi composti che potrebbero essere ancora più efficaci".
In effetti, il team sta progettando nuovi composti basati sulle strutture che hanno determinato mediante cristallografia a raggi X. Hanno anche in programma di testare i farmaci combinati che hanno già dimostrato di essere efficaci in vitro nei topi.
Sebbene gli scienziati abbiano studiato la variante Delta di SARS-CoV-2, hanno affermato che i farmaci saranno probabilmente efficaci contro Omicron e le varianti future perché prendono di mira parti del virus che è improbabile che mutino in modo significativo.
"Lo sviluppo di farmaci antivirali ad ampio spettro contro un'ampia gamma di coronavirus è la strategia di trattamento definitiva per le infezioni da coronavirus circolanti ed emergenti", ha affermato Jose. "La nostra ricerca mostra che riproporre alcuni farmaci approvati dalla FDA che dimostrano efficacia nell'inibire le attività di Mpro e PLpro può essere una strategia utile nella lotta contro SARS-CoV-2".
Riferimento: "Identificazione degli inibitori SARS-CoV-2 mirati a Mpro e PLpro utilizzando il test della proteasi in-cell" di Anoop Narayanan, Manju Narwal, Sydney A. Majowicz, Carmine Varricchio, Shay A. Toner, Carlo Ballatore, Andrea Brancale, Katsuhiko S. Murakami e Joyce Jose, 25 febbraio 2022, Biologia delle comunicazioni.
DOI: 10.1038/s42003-022-03090-9
Altri autori del documento includono Sydney A. Majowicz, studente laureato, e Shay A. Toner, studente universitario, Penn State; Carmine Varricchio, ricercatore post-dottorato, e Andrea Brancale, professore di chimica medicinale, Università di Cardiff; e Carlo Ballatore, professore di chimica medicinale, University of California, San Diego.
Il National Institutes of Health, l'Ufficio del governo gallese per la scienza e gli Huck Institutes of the Life Sciences della Penn State (COVID-19 Seed Grant for Jose Laboratory) hanno supportato questa ricerca.
