Mehrere von der FDA zugelassene Medikamente – darunter für Typ-2-Diabetes, Hepatitis C und HIV – reduzieren die Fähigkeit der Delta-Variante erheblich SARS-CoV-2 sich in menschlichen Zellen zu replizieren, laut neuer Forschung unter der Leitung von Wissenschaftlern der Penn State. Insbesondere stellte das Team fest, dass diese Medikamente bestimmte virale Enzyme, sogenannte Proteasen, hemmen, die für die Replikation von SARS-CoV-2 in infizierten menschlichen Zellen unerlässlich sind.
„Die SARS-CoV-2-Impfstoffe zielen auf das Spike-Protein ab, aber dieses Protein steht unter starkem Selektionsdruck und kann, wie wir bei Omicron gesehen haben, erhebliche Mutationen erfahren“, sagte Joyce Jose, Assistenzprofessorin für Biochemie und Molekularbiologie, Penn State . „Es besteht weiterhin ein dringender Bedarf an SARS-CoV-2-Therapeutika, die auf andere Teile des Virus als das Spike-Protein abzielen, die sich nicht so wahrscheinlich entwickeln werden.“
Frühere Forschungen haben gezeigt, dass zwei SARS-CoV-2-Enzyme – Proteasen, darunter Mpro und PLpro – vielversprechende Ziele für die Entwicklung antiviraler Medikamente sind. Pfizer's COVID-19 Therapie Paxlovid zum Beispiel zielt auf Mpro ab. Laut Jose sind diese Enzyme relativ stabil; Daher ist es unwahrscheinlich, dass sie schnell arzneimittelresistente Mutationen entwickeln.
Katsuhiko Murakami, Professor für Biochemie und Molekularbiologie, Penn State, stellte fest, dass diese Virusproteasen aufgrund ihrer Fähigkeit, Proteine zu spalten oder zu schneiden, für die Replikation von SARS-CoV-2 in infizierten Zellen unerlässlich sind.
„SARS-CoV-2 produziert daraus lange Proteine, sogenannte Polyproteine RNA Genom, das von diesen Proteasen in geordneter Weise in einzelne Proteine gespalten werden muss, was zur Bildung funktioneller Virusenzyme und Proteine führt, um die Virusreplikation zu starten, sobald es in eine Zelle eindringt“, erklärte Murakami. „Hemmt man eine dieser Proteasen, könnte eine weitere Ausbreitung von SARS-CoV-2 bei der infizierten Person gestoppt werden.“
Die Ergebnisse wurden heute (25. Februar 2022) in der Zeitschrift veröffentlicht Kommunikations-Biologie.
Das Team entwarf einen Assay zur schnellen Identifizierung von Inhibitoren der Mpro- und PLpro-Proteasen in lebenden menschlichen Zellen.
„Obwohl andere Assays verfügbar sind, haben wir unseren neuartigen Assay so konzipiert, dass er in lebenden Zellen durchgeführt werden kann, wodurch wir gleichzeitig die Toxizität der Inhibitoren für menschliche Zellen messen konnten“, sagte Jose.
Die Forscher verwendeten ihren Assay, um eine Bibliothek von 64 Verbindungen zu testen – darunter Inhibitoren von HIV- und Hepatitis-C-Proteasen; Cysteinproteasen, die in bestimmten Protozoenparasiten vorkommen; und Dipeptidylpeptidase, ein menschliches Enzym, das an Typ-2-Diabetes beteiligt ist – wegen ihrer Fähigkeit, Mpro oder PLpro zu hemmen. Von den 64 Verbindungen identifizierte das Team elf, die die Mpro-Aktivität beeinflussten, und fünf, die die PLpro-Aktivität beeinflussten, basierend auf einem Grenzwert von 50 % Reduktion der Protease-Aktivität bei 90 % Zelllebensfähigkeit.
Anoop Narayanan, außerordentlicher Forschungsprofessor für Biochemie und Molekularbiologie, überwachte die Aktivität der Verbindungen mit Live-Konfokalmikroskopie.
„Wir haben das Experiment so konzipiert, dass man Fluoreszenz in bestimmten Bereichen der Zelle sehen würde, wenn die Verbindung die Proteasen beeinflusst“, sagte Narayanan.
Als nächstes bewertete das Team die antivirale Aktivität der 16 PLpro- und Mpro-Inhibitoren gegen SARS-CoV-2-Viren in lebenden menschlichen Zellen in einer BSL-3-Einrichtung, dem Eva J. Pell ABSL-3 Laboratory for Advanced Biological Research an der Penn State, und entdeckten, dass acht von ihnen dosisabhängige antivirale Aktivitäten gegen SARS-CoV-2 aufwiesen. Insbesondere fanden sie heraus, dass Sitagliptin und Daclatasvir PLpro hemmen und MG-101, Lycorin-HCl und Nelfinavir-Mesylat Mpro hemmen. Von diesen stellte das Team fest, dass MG-101 auch das Virus behinderte's Fähigkeit, Zellen zu infizieren, indem es die Proteaseverarbeitung des Spike-Proteins hemmt.
„Wir fanden heraus, dass bei einer Vorbehandlung der Zellen mit den ausgewählten Inhibitoren nur MG-101 das Virus beeinflusste's Eintritt in Zellen“, sagte Narayanan.
Darüber hinaus fanden die Forscher heraus, dass die Behandlung von Zellen mit einer Kombination aus Mpro- und PLpro-Inhibitoren eine additive antivirale Wirkung hatte, was zu einer noch stärkeren Hemmung der SARS-CoV-2-Replikation führte.
„In der Zellkultur haben wir gezeigt, dass die Kombination von Mpro- und PLpro-Inhibitoren eine stärkere Wirkung auf das Virus hat, ohne die Toxizität zu erhöhen“, sagte Jose. „Diese kombinierte Hemmung ist hochwirksam.“
Um den Mechanismus zu untersuchen, durch den MG-101 die Aktivität der Mpro-Protease hemmt, verwendeten die Wissenschaftler, darunter Manju Narwal, Postdoktorand in Biochemie und Molekularbiologie, Röntgenkristallographie, um eine hochauflösende Struktur von MG-101 im Komplex mit zu erhalten Mpro.
„Wir konnten sehen, wie MG-101 mit dem aktiven Zentrum von Mpro interagiert“, sagte Narwal. „Dieser Inhibitor ahmt das Polyprotein nach und bindet auf ähnliche Weise an die Protease, wodurch die Protease daran gehindert wird, an das Polyprotein zu binden und es zu schneiden, was ein wesentlicher Schritt im Virus ist's-Replikation.“
Murakami fügte hinzu: „Indem wir verstehen, wie die MG-101-Verbindung an das aktive Zentrum bindet, können wir neue Verbindungen entwickeln, die möglicherweise noch effektiver sind.“
Tatsächlich ist das Team dabei, neue Verbindungen zu entwerfen, die auf den Strukturen basieren, die sie durch Röntgenkristallographie bestimmt haben. Sie planen auch, die Kombinationsmedikamente zu testen, von denen sie bereits gezeigt haben, dass sie in vitro an Mäusen wirksam sind.
Obwohl die Wissenschaftler die Delta-Variante von SARS-CoV-2 untersuchten, sagten sie, dass die Medikamente wahrscheinlich gegen Omicron und zukünftige Varianten wirksam sein werden, da sie auf Teile des Virus abzielen, die wahrscheinlich nicht signifikant mutieren werden.
„Die Entwicklung antiviraler Breitspektrum-Medikamente gegen eine Vielzahl von Coronaviren ist die ultimative Behandlungsstrategie für zirkulierende und neu auftretende Coronavirus-Infektionen“, sagte Jose. „Unsere Forschung zeigt, dass die Umnutzung bestimmter von der FDA zugelassener Medikamente, die eine Wirksamkeit bei der Hemmung der Aktivitäten von Mpro und PLpro zeigen, eine nützliche Strategie im Kampf gegen SARS-CoV-2 sein kann.“
Referenz: „Identification of SARS-CoV-2 inhibitors targeting Mpro and PLpro using in-cell-protease assay“ von Anoop Narayanan, Manju Narwal, Sydney A. Majowicz, Carmine Varricchio, Shay A. Toner, Carlo Ballatore, Andrea Brancale, Katsuhiko S. Murakami und Joyce Jose, 25. Februar 2022, Kommunikations-Biologie.
DOI: 10.1038/s42003-022-03090-9
Weitere Autoren des Papiers sind Sydney A. Majowicz, Doktorand, und Shay A. Toner, Student, Penn State; Carmine Varricchio, Postdoctoral Research Associate, und Andrea Brancale, Professorin für Medizinische Chemie, Cardiff University; und Carlo Ballatore, Professor für medizinische Chemie, University of California, San Diego.
Die National Institutes of Health, das Welsh Government Office for Science und die Huck Institutes of the Life Sciences at Penn State (COVID-19 Seed Grant for Jose Laboratory) unterstützten diese Forschung.
